一种基于免疫亲和的微流控芯片，HBEXO-Chip，可以分离血浆中的外泌体。
Introduction
外泌体是一种脂膜包裹的纳米囊泡（直径30-50 nm），通过溶酶体途径由各种类型的细胞分泌而来。当前，外泌体在液体活检中获得了极大关注，因为它们的体液中含量很高，并且包含源自亲代细胞的丰富生物信息，例如mRNA，miRNA和蛋白质。肿瘤来源外泌体携带了多种与肿瘤发生、进展和代谢相关的肿瘤特异性分子生物信息。因此肿瘤外泌体是一种用于癌症预后的早起诊断和预测的理想生物标记物。
然而外泌体的临床应用以其缺乏有效分离技术而受限制。
- 最常用的外泌体分离方法为超速离心法，主要依赖于它们的物理性质。但超离心法产生的外泌体产量低且非特异性，可能会影响下游RNA和蛋白质的分子分析。此外，超速离心非常耗时（>10 h）且需要昂贵的仪器，使其难以用于临床研究。
- 除了超速离心法，许多基于聚合物的外泌体试剂盒使用聚合物沉淀剂（例如乙二醇）来沉淀外泌体。但是，该方法也会产生大量的蛋白质杂质，在下游分析时可能会导致假阳性结果。
- 此外，传统的流式细胞仪检测的最小直径为200 nm，因此不适用于外泌体检测。
因此作者提出了一种基于免疫亲和的微流控芯片，HBEXO-Chip，可以分离血浆中的外泌体。微流控装置由诸多鱼骨状微混合器组成，可以用于产生有效的各向异性流以增加外泌体与特异性抗体结合的机会。Glypican-1是一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan, HSPG）家族成员，在胰腺癌中表达很高。此外，GPC1参与肿瘤增殖和代谢。因此使用GPC1靶点去捕获胰腺癌来源的外泌体。
作者证明了HBEXO-Chip设备可以有效捕获血浆中肿瘤来源的外泌体，捕获效率为75％。与类似的研究相比获得了良好的捕获效率。与传统方法相比，独特的鱼骨状结构设计使肿瘤来源的外泌体富集率提高了4倍以上。接下来，通过从健康人和患者中分离GPC1+外泌体来证明设备的临床潜力。重要的是，受益于GPC1对胰腺癌的高度特异性，作者分离出的GPC1+外泌体可能更好地反映了胰腺癌的分子特征。 RNA测序揭示了81种差异表达的miRNAs的存在，这些miRNAs与细胞骨架，细胞迁移，代谢和癌症有关。最后，作者在这些DEMS（differentially expressing miRNA）中发现了两个对胰腺癌具有诊断价值的miRNA。
Fig. 1
- （a-b）共聚焦显微镜下的HBEXO-Chip鱼骨状混合器。
- （c-d）扫描电子显微镜下的HBEXO-Chip鱼骨状混合器。
- （e）微流控芯片侧视图。
- （f）HBEXO-Chip的物理图片。
Fig. 2
- （a）外泌体捕获和释放示意图。
- （b）Glycine-HCl和Tris-Cl缓冲液的洗脱中和曲线。
- （c）通过NTA（n = 3）定量结果比较Gly-HCl缓冲液、PBS缓冲液和对照的洗脱效率。可以发现Gly-HCl缓冲液洗脱效率更高。
Fig. 3
- （a）使用浓度分别为5、10和15 μg/mL的GPC1抗体捕获外泌体。NTA计数显示3组之间没有显著性差异。
- （b）平滑通道芯片和HBEXO-Chip捕获外泌体的效率。
- （c-e）透射电镜（TEM）、NTA分析和Western-blog被用于表征panc-1细胞的外泌体分泌。
- （f）HBEXO-Chip和超速离心法的表现比较。来自健康捐献者的血浆被散播了分离自PANC-1细胞的荧光外泌体，分别通过微流控装置和超速离心装置。RT-PCR被用于定量不同技术中eGFP复制的总数量。
Fig. 4
- （a）分离自健康、胰腺炎和胰腺癌病人血浆中GPC1+外泌体的NTA计数。用于控制组的HBEXO-Chip没有结合GPC1抗体，血浆样本取自胰腺癌病人。结果表明，胰腺癌患者可以通过GPC1+外泌体与健康人和胰腺炎患者区分开。
- （b）HBEXO-Chip分离的肝癌和胰腺癌病人血清中GPC1+外泌体的NTA计数。结果表明，GPC1+外泌体具有鉴别诊断胰腺癌和肝癌的价值。
Fig. 5
- （a）胰腺癌病人组中81个不同差异表达miRNA的热图。其中，13个miRNA上调，68个miRNA下调。
- （b）KEGG通路富集的条形图。
- （c）条形图显示了DEMs在每个KEGG通路的靶向基因（mRNA），共有972个mRNA，主要与细胞骨架、细胞迁移、代谢和癌症相关通路有关。
Fig. 6
对血浆外泌体中miR-214-3p和miR-125b-5p的miRNA表达进行定量。选择原则：1. miRNA被报道在胰腺癌中有重要作用；2. miRNA同时在外泌体测序和组织测序中上调。
- （a）RT-PCR结果显示，胰腺癌血浆与健康控制组相比，miR-214-3p水平提高。
- （b）miR-125b-5p趋势同上。
Discussion
开发了一种高度特异性和快速的外泌体分离微流控芯片，以帮助鉴别胰腺癌中不同表达的miRNA标记物候选。
- 该装置增加了肿瘤特异性外泌体的富集效率。
- 通过定量GPC1+外泌体浓度成功诊断胰腺癌。
- 利用患者血浆鉴定胰腺癌的miRNA特征。
- 胰腺癌病人血浆外泌体中，miR-214-3p和miR-125b-5p表达更高。
Reference
Zhang Y, Tong X, Yang L, et al. A herringbone mixer based microfluidic device HBEXO-chip for purifying tumor-derived exosomes and establishing miRNA signature in pancreatic cancer[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2021, 332: 129511.
